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1999年，一名患有鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥的患者接受一劑攜帶校正基因的腺病毒載體注射，產(chǎn)生大規(guī)模免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多器官衰竭和腦死亡。由于1999到2002年遭遇的這一事故和其他臨床挫折，基因治療領(lǐng)域的投資在隨后的幾年中經(jīng)歷了急劇而持續(xù)的下降。

但與此同時(shí)，為了確保將外源DNA更安全地引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和生物體中，技術(shù)革新仍在繼續(xù)。例如，基因遞送系統(tǒng)的改進(jìn)使得細(xì)胞因子、siRNA和其他基因替代策略的遞送更安全，且在體外、體內(nèi)臨床前和臨床應(yīng)用中都體現(xiàn)出了有效性。

分類和基本概念

廣義的基因治療的概念即將外源性基因遞送到靶細(xì)胞，以調(diào)節(jié)、改變基因組的表達(dá)。主要有三種不同的方法（圖1）?；蜻f送載體的主要特征和組成在很大程度上取決于使用的基因治療方法（如表一）。

· 基因增補(bǔ)：該方法通常用于面對(duì)遵循常染色體隱性遺傳模式的遺傳性疾病，多用的多核苷酸為質(zhì)粒 (pDNA)，而由質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染通常只能保持1~2個(gè)月；另一種常用的為單鏈mRNA，它的穩(wěn)定時(shí)間更短，僅約1小時(shí)。

· 基因抑制：該方法主要用于沉默突變基因的表達(dá)。這這種情況常見(jiàn)于常染色體顯性遺傳之后的遺傳性疾病模式。抑制序列可以是基于單鏈RNA的結(jié)構(gòu)，如microRNA (miRNA)，或雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，如小干擾RNA (siRNA)。

· 基因編輯：用特定的基因編輯工具糾正突變基因，如CRISPR/Cas9。如CRISPR/Cas9的基因編輯工具可以用不同的載體進(jìn)行遞送，如pDNA、mRNA或核糖核蛋白 (RNP)復(fù)合物，以作用于不同的細(xì)胞區(qū)域。

圖1 三種不同類型基因治療（廣義）示意圖。a) 基因增補(bǔ)療法；b)  基因抑制療法；c) 基因編輯

表1 寡核苷酸基因治療中使用的主要多核苷酸的基本特征和性質(zhì)示意圖

病毒載體和非病毒載體

載體是目的基因到達(dá)其目標(biāo)目的地的載體，它在產(chǎn)品的安全性和有效性上起到了至關(guān)重要的作用。常見(jiàn)的遞送載體可分為病毒載體和非病毒載體。當(dāng)前一部分的臨床研究已經(jīng)應(yīng)用了非病毒載體，但更多的還是保持了傳統(tǒng)的病毒載體系統(tǒng)。

目前市場(chǎng)上有超過(guò)20種基因治療產(chǎn)品，其中3種為非病毒產(chǎn)品（如表2），其余均采用病毒載體遞送系統(tǒng)。Neovasculogen是第一個(gè)非病毒基因治療產(chǎn)品，由人類干細(xì)胞研究所（俄羅斯）開(kāi)發(fā)。它由編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-165）的質(zhì)粒作為載體。第二個(gè)產(chǎn)品是Collategene，一種編碼AnGes（日本）開(kāi)發(fā)的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）基因的質(zhì)粒DNA。

表2 使用非病毒載體遞送的基因治療產(chǎn)品

病毒載體可以高效遞送基因，有效生成持續(xù)修飾的哺乳動(dòng)物基因組。但同時(shí)，它們也存在一些限制和缺點(diǎn)。

1. 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒（包括慢病毒）載體存在插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)；

2. 使用病毒載體，免疫原性反應(yīng)和炎癥增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)增加；

3. 當(dāng)病毒DNA作為外來(lái)DNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，它容易出現(xiàn)表觀遺傳沉默；

4. 病毒生產(chǎn)所需的成本高，對(duì)于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)控制成本并不友好。

非病毒載體可以一定程度上避免病毒載體的限制，它具有以下優(yōu)勢(shì)：

1. 使用非病毒載體更容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和化學(xué)表征，能夠大規(guī)模提高生產(chǎn)的可重復(fù)性；

2. 非病毒載體具有更高的載量，更大的轉(zhuǎn)基因能力；

3. 使用非病毒載體毒性低，免疫原性反應(yīng)小，安全性更高。

然而依然有一定的壁壘存在。與病毒載體系統(tǒng)相比，非病毒系統(tǒng)的效率仍然相對(duì)較低，因?yàn)榫幋a轉(zhuǎn)基因的表達(dá)仍然是短暫的。為了克服非病毒載體固有的挑戰(zhàn)，仍然需要進(jìn)行技術(shù)的優(yōu)化和革新以確保非病毒系統(tǒng)的穩(wěn)定性和有效性。

非病毒載體在體外細(xì)胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用

在體外細(xì)胞治療領(lǐng)域，除了常見(jiàn)的用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體引入CAR基因的方式，還有轉(zhuǎn)座子、mRNA、CRISPR/Cas9的方式。

· 轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座子由一個(gè)攜帶CAR的質(zhì)粒和一個(gè)攜帶轉(zhuǎn)座子酶的質(zhì)粒組成。它具有裝載量大、安全性高等優(yōu)勢(shì)。這類新系統(tǒng)已證明能夠?qū)崿F(xiàn)較為安全的基因整合，同時(shí)保持高效的遞送效率，有限的脫靶效應(yīng)，并可以生成基因表達(dá)穩(wěn)定可靠的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有睡美人轉(zhuǎn)座子（Sleeping Beauty，SB），PiggyBac等。

· mRNA: mRNA電穿孔是將CAR基因?qū)?/span>T細(xì)胞的方法，但是可以轉(zhuǎn)染的基因容量更小，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)于病毒載體以及轉(zhuǎn)座子而言都要更低。不過(guò)這種方法相對(duì)而言成本更低，耗時(shí)更短，安全性相對(duì)較好，沒(méi)有插入誘變，并且免疫原性可以忽略不計(jì)。

· CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是當(dāng)前使用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，它可以通過(guò)敲除TRAC等分子，避免GVHD和免疫排斥使CAR-T變成通用型；還可以敲除免疫檢查點(diǎn)或抑制性分子來(lái)提高T細(xì)胞或者其它免疫細(xì)胞的功能。

無(wú)論哪種非病毒技術(shù)，都需要將外源基因通過(guò)一種高效的方法導(dǎo)入到大量的細(xì)胞中。電穿孔已被證明是非病毒轉(zhuǎn)染中前景、且已經(jīng)是應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。

電穿孔技術(shù)的應(yīng)用

目前已上市的電穿孔平臺(tái)，存在以下缺點(diǎn)：

· 平臺(tái)不開(kāi)放，參數(shù)調(diào)整優(yōu)化難

· 體系放大一致性欠佳，工藝開(kāi)發(fā)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化難

· 亦或是商業(yè)模式不大友好，使用成本高昂

尋找降本增效的電轉(zhuǎn)方案是行業(yè)一致的訴求。

在電轉(zhuǎn)技術(shù)方面，賽默飛早有儲(chǔ)備。10多年前賽默飛已推出了Neon電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，N在高校和科研院所廣泛應(yīng)用，在免疫細(xì)胞中基因編輯領(lǐng)域積累豐富經(jīng)驗(yàn)?；谂c細(xì)胞治療領(lǐng)域?qū)I(yè)客戶的多年深度合作，賽默飛于2022年推出Gibco™ CTS™ Xenon™大規(guī)模電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，保持了與Neon一致的脈沖配置和開(kāi)放的操作平臺(tái)，通過(guò)簡(jiǎn)單的優(yōu)化，即可實(shí)現(xiàn)研發(fā)到生產(chǎn)的體系放大。此外，滿足大體積、符合GMP生產(chǎn)需求的Xenon也不會(huì)收取任何license fee或milestone費(fèi)用，真正做到降本增效。

圖2 Gibco™ CTS™ Xenon™大規(guī)模細(xì)胞電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

Gibco CTS Xenon 電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)特點(diǎn)

· 處理量大且快速：處理量為1–25mL，25分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)染多達(dá)2.5x10?個(gè)T細(xì)胞；

· 性能可靠，可保持高細(xì)胞活力：高達(dá)90%的基因敲除效率和80%的細(xì)胞活力；

· 工藝靈活性高：儀器配備了用戶可編程系統(tǒng)，允許用戶在細(xì)胞治療的工藝開(kāi)發(fā)到商業(yè)化生產(chǎn)的所有階段，根據(jù)各種細(xì)胞類型和目標(biāo)遞送物創(chuàng)建并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染方案；

· 非病毒性物理轉(zhuǎn)染：可用于遞送DNA、RNA和蛋白質(zhì)；

· 封閉式系統(tǒng)處理工藝：MultiShot(MS)耗材可以無(wú)菌焊接至PVC管或C-Flex管。

Gibco CTS Xenon 電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)特應(yīng)用案例

1. Gibco™ CTS™ Xenon™實(shí)現(xiàn)高效T細(xì)胞基因編輯

使用Cas9/gRNA敲除內(nèi)源性T細(xì)胞受體（TCR）并敲入表達(dá)第二代CAR構(gòu)建體的雙鏈線性DNA。使用Invitrogen™ Neon™電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（100 μL），或在CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)染儀器上使用Xenon SingleShot電轉(zhuǎn)染腔室（1 mL）或Xenon MultiShot電轉(zhuǎn)染套件（18 mL）轉(zhuǎn)染5×10?個(gè)細(xì)胞/mL，并設(shè)置未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染3天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估CAR T細(xì)胞上的CD19基因表達(dá)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和Gibco臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活性。

圖3 對(duì)三個(gè)來(lái)源于白細(xì)胞單采術(shù)的T細(xì)胞供體進(jìn)行CAR T細(xì)胞電轉(zhuǎn)染分析

2. Gibco™ CTS™ Xenon™可實(shí)現(xiàn)高效NK細(xì)胞基因編輯

使用Cas9/gRNA敲除內(nèi)源性B2M基因。使用Invitrogen™ Neon™電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（100 μL），或在CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)染儀器上使用Xenon SingleShot電轉(zhuǎn)染腔室（1 mL）5×10?個(gè)細(xì)胞/mL。轉(zhuǎn)染3天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估NK細(xì)胞陽(yáng)性率（中間列）及B2M基因敲除效率（左邊2列）。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和Gibco臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活性（右列）。

圖4 三個(gè)來(lái)源于白細(xì)胞單采術(shù)的NK細(xì)胞使用CTS NK-Xpander培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，計(jì)數(shù)并進(jìn)行NK細(xì)胞電轉(zhuǎn)染分析

3. Gibco™ CTS™ Xenon™可助力大規(guī)模HSC (CD34+ T)細(xì)胞的基因改造

在電穿孔后的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，不同系統(tǒng)間細(xì)胞活力相當(dāng) (A)， 基因編輯效率也都維持比較高的水平，CTS Xenon 1ml SS平均編輯效率為82%±9，Multi-shot平均為75%±8 / 5ml，Neon 100 μL平均基因編輯效率為81%±7(B)。

圖5 分別使用Neon 100 μL系統(tǒng)和Xenon 1ml SS及5-25ml MS系統(tǒng)電轉(zhuǎn)HSCs細(xì)胞，評(píng)價(jià)Neon到Xenon的可擴(kuò)展性

Xenon系統(tǒng)可提供多款電轉(zhuǎn)染緩沖液。CTS Xenon 電轉(zhuǎn)緩沖液（EP buffer）、基因組編輯緩沖液（GE buffer）和低電導(dǎo)率電轉(zhuǎn)緩沖液（LC buffer)，專為與CTS Xenon 系統(tǒng)配合使用而設(shè)計(jì)，可提供100 mL 瓶裝和袋裝形式，便于工藝開(kāi)發(fā)和封閉式系統(tǒng)生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大。

Gibco CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)

為了滿足細(xì)胞治療生產(chǎn)工藝往自動(dòng)化封閉式的生產(chǎn)需求，我們開(kāi)發(fā)出成熟工藝，利用CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)靈活、溫和、輸出體積可低至5ml的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)電轉(zhuǎn)前細(xì)胞電轉(zhuǎn)液的小體積、高密度、封閉式置換，輸出密度可高達(dá)5E8細(xì)胞/ml，回收率>80%，活率> 90%。

圖6 Rotea與Xenon物理連接：利用Rotea將待電轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行洗滌并置換成電轉(zhuǎn)液，然后通過(guò)管路無(wú)菌熱接接至Xenon multishot管路中，將需電轉(zhuǎn)的細(xì)胞以及payload泵至Xenon電轉(zhuǎn)儀，實(shí)現(xiàn)全封閉的電轉(zhuǎn)流程。

Rotea可做到高精準(zhǔn)度、低體積輸出并維持高細(xì)胞活率和高回收率的儀器，我們也經(jīng)過(guò)內(nèi)部和客戶多方測(cè)試，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)洗滌濃縮置換電轉(zhuǎn)液的樣品，后續(xù)基因編輯效率與細(xì)胞活率都與手工離心置換電轉(zhuǎn)液組相當(dāng)。

圖7  單采血分離PBMC后，使用dynabeads 一步法分離與激活T細(xì)胞。2天后，分別用Rotea和手工離心對(duì)激活的T細(xì)胞進(jìn)行洗滌和電轉(zhuǎn)液置換，隨即進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)分別采用Neon小電轉(zhuǎn)和CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)進(jìn)行測(cè)試。圖中上部分為基因編輯效率，在電轉(zhuǎn)3天后，3個(gè)不同的donor中，Rotea組和手工離心組的基因編輯效率都是相當(dāng)?shù)模?/span>Xenon在21%-36%，Neon為10%-15%。圖下半部分展示了對(duì)應(yīng)各組細(xì)胞活率，均維持在90%左右。

總結(jié)

基于在非病毒細(xì)胞改造技術(shù)方面的多年經(jīng)驗(yàn)積累，在結(jié)合如CTS Dynabeads、OpTmizer™ Pro，NK-Xpander培養(yǎng)基等高品質(zhì)的原材料和Attune流式在線分析和qPCR等質(zhì)控分析方案基礎(chǔ)上，賽默飛全新推出如CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)儀、CTS Rotea逆流離心細(xì)胞處理系統(tǒng)以及DynaCellect新一代自動(dòng)化磁珠分選平臺(tái)，通過(guò)各儀器的物理連接及Cellmation數(shù)字化整合軟件，賽默飛打造了封閉式、模塊化和自動(dòng)化非病毒細(xì)胞治療生產(chǎn)解決方案。這一套可擴(kuò)展性生產(chǎn)解決方案，可幫助大家實(shí)現(xiàn)不同類型細(xì)胞療法的降本增效及國(guó)際化工藝生產(chǎn)的需求。

圖8 賽默飛非病毒細(xì)胞治療生產(chǎn)解決方案概覽

此外，賽默飛基于CTS Rotea和CTS Xenon構(gòu)建了封閉式整合平臺(tái)，并實(shí)現(xiàn)了CAR T細(xì)胞的高效生產(chǎn)。基于CTS 儀器的模塊化特性，加上其數(shù)字化和物理整合能力，可靈活配置滿足多樣化生產(chǎn)需求。掃描下方二維碼獲取“采用封閉式集成式儀器工作流程，高效生產(chǎn) CAR T 細(xì)胞"原文。