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蛋白質(zhì)相互作用質(zhì)譜分析是研究蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要技術(shù)，廣泛應(yīng)用于疾病機制、信號通路解析和藥物靶點發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。以下是其核心內(nèi)容和關(guān)鍵步驟的整理：
1. 基本原理
目標：通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定與目標蛋白（bait protein）直接或間接結(jié)合的蛋白質(zhì)。
策略：結(jié)合生化富集（如免疫共沉淀、親和純化）和高靈敏度質(zhì)譜分析。
2. 實驗流程
(1) 樣品制備
蛋白復(fù)合體富集：
免疫共沉淀（Co-IP）：利用抗體捕獲目標蛋白及其互作蛋白。
親和純化（AP-MS）：使用標簽（如Flag、HA）純化重組蛋白復(fù)合物。
交聯(lián)技術(shù)（Crosslinking）：穩(wěn)定瞬時或弱相互作用（如甲醛交聯(lián)）。
裂解條件優(yōu)化：使用溫和裂解緩沖液避免復(fù)合體解離，添加蛋白酶抑制劑。
(2) 質(zhì)譜分析
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）：
酶解：用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)為肽段。
分離：通過液相色譜分離肽段。
檢測：高分辨率質(zhì)譜（如Orbitrap、Q-TOF）分析肽段序列。
定量方法：
標記定量：TMT、SILAC（標記不同樣本的蛋白質(zhì)）。
無標記定量（Label-free）：基于肽段信號強度比較。
(3) 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)庫搜索：
工具：MaxQuant、Proteome Discoverer、Mascot。
數(shù)據(jù)庫：UniProt、Swiss-Prot。
互作蛋白篩選：
排除污染物（如角蛋白）和常見非特異性結(jié)合蛋白。
對比陰性對照組（如空載體或無關(guān)抗體樣本）。
生物信息學分析：
功能注釋：GO、KEGG分析互作蛋白的生物學功能。
網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：使用Cytoscape可視化互作網(wǎng)絡(luò)。
驗證工具：STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測互作可靠性。
3. 關(guān)鍵挑戰(zhàn)與解決方案
假陽性/假陰性：
嚴格對照：設(shè)置多個陰性對照（如IgG對照、敲除目標蛋白的細胞）。
統(tǒng)計學過濾：基于顯著性（p-value）和豐度倍數(shù)變化篩選。
弱/瞬時相互作用：
使用交聯(lián)劑（如DSS）穩(wěn)定復(fù)合物。
提高質(zhì)譜靈敏度（如DIA模式）。
數(shù)據(jù)復(fù)雜性：
機器學習輔助篩選（如SAINT、CRAPome數(shù)據(jù)庫去污染）。
4. 應(yīng)用場景
疾病機制：發(fā)現(xiàn)癌癥中異?；プ鞯牡鞍祝ㄈ鏓GFR信號網(wǎng)絡(luò)）。
藥物靶點：鑒定藥物（如激酶抑制劑）結(jié)合的蛋白復(fù)合物。
結(jié)構(gòu)生物學：結(jié)合冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)。
5. 前沿技術(shù)
交聯(lián)質(zhì)譜（CX-MS）：直接鑒定互作位點。
鄰近標記技術(shù)（如BioID、TurboID）：在活細胞中標記鄰近蛋白，提高空間特異性。
單細胞質(zhì)譜：研究細胞異質(zhì)性中的蛋白互作。
6. 注意事項
實驗設(shè)計：至少3次生物學重復(fù)以提高可信度。
樣本處理：避免反復(fù)凍融和過度離心。
數(shù)據(jù)分析：多軟件交叉驗證結(jié)果（如同時使用MaxQuant和PD）。
如果需要進一步探討具體實驗方案或數(shù)據(jù)分析工具，可以提出更詳細的問題！
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